Направления клиники

Цитоплазматические включения подобные хламидиям расшифровка

Цитоплазматические включения хламидий в эпителиальных клетках

Обнаружение цитоплазматических включений хламидий в эпителиальных клетках в соскобах из уретры, окрашенных по Романовскому-Гимзе, являлось классическим методом диагностики. В посевах отделяемого из уретры, простатического сока, спермы у обследуемых больных в 47,1% определяли кроме хламидии другие возбудители воспаления (гемолитический стафилококк – 72,3%, микоплазма – 5,4%, уреаплазма – 22,3%).

Исследования эякулята у 18 инфертильных пациентов на фоне хламидийной инфекции выявляли те или другие нарушения отдельных параметров спермы. В той или иной степени уменьшалось количество сперматозоидов, снижалась их подвижность, имела место лейкоцитоспермия, агглютинация спермиев, снижение уровня фруктозы и цитрата цинка. Подобные изменения, по нашему мнению, обусловлены преимущественно инфекционно-токсическим фактором воздействия на функциональную способность придаточных половых желез, обеспечивающих сперматогенез.

На фоне урогенитального хламидиоза наблюдалось нарушение потенции у большинства пациентов (78,8%). Подовая дисфункция у части из них сопровождалась “стертым” оргазмом (44,0%), ускоренной эякуляцией (60,9%), оргастическими и посторгастическими болевыми ощущениями (31,7%). Подобные разнообразные проявления копулятивяой дисфункции необходимо с известной долей условности рассматривать о выделением главного причинного фактора. Этот факт заставляет нацеливать врача на поиск морфофункциональных признаков, обуславливающих тот или иной синдром.

Лабораторная диагностика хламидиоза

Проводят индикацию хламидий непосредственно в пораженных клетках, выделение хламидий и обнаружение хламидийных антител.

Индикация хламидий непосредственно в пораженных клетках. Этот метод предусматривает выявление цитоплазматических включений, образуемых хламидиями, при окрашивании морфологических структур микроорганизма или его антигенов. Материалом служат соскобы с доступных слизистых оболочек мочеполовых органов (мочеиспускательный канал, шейка матки, канал шейки матки) и других органов (конъюнктива, прямая кишка и др.) при экстра генитальных формах хламидийной инфекции. Реже исследуют мазки — отпечатки выделений, секретов и тканей, биопсированных при хирургических вмешательствах.

Выявление морфологических структур микроорганизма. Обнаружение цитоплазматических включений хламидий в эпителиальных клетках препаратов, окрашенных по методу Романовского — Гимзы, является классическим методом диагностики хламидиозов,

Цитоплазматические включения представляют собой компактные или рыхло расположенные зернистые массы, содержащие морфологические структуры возбудителя на разных этапах его размножения. Они часто определяются вблизи ядра, нередко смещают его к периферии клетки, имеют разнообразную, правильную или неправильную форму, отличаясь по цвету и внутренней структуре от ядра и цитоплазмы (рис. 82). Мелкие, ранние включения, содержащие крупные тельца диаметром 0,5—1,2 мкм, имеют сине-фиолетовый цвет. Крупные включения, содержащие преимущественно мелкие зрелые структуры возбудителя, имеют розово-красный цвет. Часто в одной клетке выявляются включения хламидий разной зрелости и различной плотности расположения. Нередко при рыхлом расположении морфологических структур микроорганизма обнаруживается содержащая их вакуоль.

Во избежание диагностических ошибок цитоплазматические включения следует четко дифференцировать с другими структурными образованиями, которые могут встречаться в исследуемых препаратах. Это пигментные гранули черного или темно-зеленого цвета, иногда располагающиеся в цитоплазме у ядра в виде зернистых масс: зернистые структуры травмированного ядра, сходные по цвету, форме и размерам с ядерным материалом неповрежденных клеток; зерна муцина, окрашивающиеся в красный или синий цвет, располагающиеся в цитоплазме отдельно друг от друга; эозинофильные зерна разрушенных эозинофилов, располагающиеся одиночно или на поверхности эпителиальных клеток; диффузная эозинофильная многомерная зернистость цитоплазмы; клеточный детрит, адсорбированный на поверхности или фагоцитированный эпителиальной клеткой; сопутствующая микрофлора, включающая гонококки, стрептококки, пневмококки, дифтероиды и другие микроорганизмы, которые обычно выявляются не только на поверхности эпителиальных клеток, но и на других участках препарата.

Выявление цитоплазматических включений в препаратах из соскобов позволяет в целом диагностировать около 10—15 % случаев хламидийной инфекции, протекающей как манифестно, так и бессимптомно.

Выявление антигенов микроорганизма. Для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции используют метод флюоресцирующих антител, основанный на классических разработках Coons, Kaptan, который широко применяется при диагностике многих вирусных и бактериальных инфекций. Сущность его заключается в соединении антител, меченных флуорохромом, со специфическим антигеном и наблюдении продукта реакции под люминесцентным микроскопом.

Обнаружение цитоплазматических включений хламидий в эпителиальных клетках препаратов из соскобов с помощью флюоресцирующих антител является высокочувствительным и специфическим методом диагностики урогенитальной хламидийной инфекции. Во избежание диагностических ошибок нужно использовать реагенты высокого качества, обеспечить контроль и строгую оценку результатов.

Метод флюоресцирующих антител для выявления антигенов хламидий в цитоплазматических включениях можно использовать в прямой и непрямой модификациях. Метод прямой иммунофлюоресценции требует флюоресцирующей хламидийной антисыворотки, метод непрямой иммунофлюоресценции (НПФ) — сыворотки человека или животного, содержащей хламидийные антитела, и соответствующей антивидовой флюоресцирующей сыворотки, обычно промышленного выпуска. В тест-системе метода прямой иммунофлюоресценции, разработанного и апробированного для индикации хламидий в различных материалах, используют овечью хламидийную антисыворотку, меченную флюоресцеина изотиоцианатом, и для контрастирования фона препарат — бычий альбумин, меченный родамином, выпускаемый НИИЗМ им, Н.Ф. Гамалеи АМН России. При люминесцентной микроскопии антигены хламидий выявляются на темном или оранжевом (при контрастировании родамином) фоне цитоплазмы эпителиальных клеток в виде цитоплазматических включений флюоресцирующих ярко-зеленым или желтовато-зеленым цветом. Флюоресцирующие включения могут иметь гомогенную, зернистую или смешанную структуру. Специфическая флюоресценция может соответствовать или не соответствовать топографии цитоплазматических включений, а также выявляться в клетках, в которых не удается обнаруживать морфологические структуры хламидий при окраске по Романовскому — Гимзе.

Большая диагностическая информативность метода флюоресцирующих антител связана с тем, что с его помощью выявляются не только корпускулярные, но и растворимые антигены хламидий, его показатели меньше зависят от изменения тинкториальных свойств хламидий в процессе инфекции, особенно при этиотропной терапии и, наконец, с тем, что светящиеся антигены хламидий выявляются легко и быстро.

Диагностическое выделение хламидий. Диагноз заболевания доказывает выделение возбудителя. Используемые методы требуют специального оснащения и соответствующей квалификации персонала.

Диагностическое выделение хламидий при урогенитальной хламидийной инфекции проводят в эпителиальных клетках оболочек желточных мешков развивающихся куриных эмбрионов и в культуре клеток, наиболее широко используемой в настоящее время.

Важнейшие условия получения правильных результатов — надежное освобождение исследуемого материала от сопутствующей бактериальной флоры и предупреждение инактивации хламидий при транспортировке и хранении материала. Это достигается обработкой исследуемых образцов антибиотиками, не влияющими на жизнедеятельность хламидий и одновременно оказывающими бактерицидное действие на сопутствующую микрофлору, а также использованием транспортных сред, низких температур и максимальным сокращением сроков между сбором материала и его введением в куриные эмбрионы или в культуру клеток.

Хламидии лучше выявляются (особенно при заражении куриных эмбрионов) из интенсивно инфицированной) первичного материала, взятого у больных, не получавших антихламидий ной терапии. Тем не менее и при хронических формах хламидийной инфекции, а также при ее бессимптомном течении эти методы Дают ценную диагностическую информацию.

Выделение хламидий в куриных эмбрионах. Выделение хламидий в 6—8-дневных развивающихся куриных эмбрионах, зараженных в желточный мешок, долго был единственным методом надежной этиологической диагностики хламидийных инфекций и остается высокоспецифическим методом диагностики урогенитальной хламидийной инфекции, ее экстрагенитальных проявлений, а также венерической лимфогранулемы.

Этот метод по чувствительности близок методу диагностического выделения хламидий в культуре клеток и несколько уступает методу флюоресцирующих антител, используемому для выявления антигенов микроорганизма в инфицированных клетках.

Критериями диагностического выделения хламидий являются наличие морфологических структур микроорганизма и содержание родоспецифического антигена. Специфическая летальность эмбрионов обычно проявляется в последующих пассажах.

Рассматриваемый метод технически прост, но он трудоемкий и длительный (от 7—12 дней до 3—4 нед с учетом проведения 2—3 слепых пассажей), что ограничивает его практическое применение при наличии ускоренных методов этиологической диагностики инфекции. В то же время его широко используют при установлении хламидийной этиологии различной патологии, для получении лабораторных культур хламидий и в различных научных исследованиях.

Выделение хламидий в культурах клеток. Большинство представителей вида С. trachomatis, за исключением возбудителя венерической лимфогранулемы, не способны в стандартных условиях инфицировать клетки и размножаться в различных культурах клеток. Это обстоятельство долго ограничивало использование метода культур клеток для диагностики урогенитальных хламидиозов и хламидиозов другой локализации.

Избежать этого помогло использование дополнительных методических приемов, способствующих повышению адсорбции микроорганизма на поверхности клеток, активации его поглощения клеткой и подавлению ее нормального метаболизма. С этой целью широко применяют как самостоятельно, так и в различных комбинациях центрифугирование инфекционного материала на монослой клеток, облучение клеток рентгеновскими лучами, обработку монослоя клеток ДЕАЕ-декстраном — поликатионом, активирующим поглощение макромолекул, обработку клеток 5-йод-2-дезоксиуридином или циклогексимидом — антиметаболитами, обладающими цитостатическим действием.

В настоящее время для диагностического выделения хламидий из мочеполовых органов наиболее часто используют клетки McCoy-, HeLa-22 9 и L-929.

Обнаружение хламидийных антител. Для серодиагностики и изучения эпидемиологии урогенитальных и сходных с ними хламидиозов другой локализации в настоящее время используют два метода — общепринятую PCK с родоспепифическим антигеном (общим для С. trachomatis и С. psittaci) и микрометод реакции НИФ с типоспецифическими антигенами С. trachomatis. Реакция НИФ в различных модификациях находит все более широкое применение как. с целью серодиагностики хламидийной инфекции, так и для установления иммунотипов С. trachomatis, циркулирующих в регионе.

Благодаря исследованиям и практическим разработкам Э.С. Горовиц, О.А. Тимашевой налаживается промышленное производство сухих орнитозных диагноста кумов эритроцитарного для реакции непрямой гемагглютинации (PHГ) и диагностикума для иммунофлюоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА). Эти серологические реакции, безусловно, найдут широкое применение в серодиагностике не только орнитоза, но и других, хламидиозов. Высоких результатов выявления урогенитальной хламидийной инфекции следует ожидать при использовании типоспецифических антигенов С. trachomatis.

Одним из перспективных методов серодиагностики хламидиозов является и вариант иммуноферментного метода — микрометод ELISA, который оказался значительно более чувствительным? чем РСК, и конкурирует с микрометодом НИФ при орнитозе и хламидийном уретрите.

ladycaramelka.ru

Диагностика хламидиоза. Материал для врачей.

Нужно отметить, что хламидии не относятся к нормальной микрофлоре человека; их обнаружение указывает на наличие инфекционного процесса, ими обусловленного. В связи с этим лабораторная диагностика хламидиоза имеет решающее значение (определение хламидий в пораженных клетках, выделение возбудителя в культурах клеток, обнаружение хламидийных антител; данные молекулярно-биологических методов диагностики).

Прежде чем идти далее, предлагаю вам ознакомиться со следующими статьями:

Симптомы и лечение хламидиоза.
Хламидиоз у мужчин.
Хламидиоз у женщин.

Лабораторные методы диагностики хламидиоза:

1) Выявление морфологических структур хламидий в исследуемом материале при окраске по Романовскому-Гимза (непосредственно в пораженных клетках). Для подтверждения этиологического диагноза необходимо обнаружить от 5 до 10 типичных цитоплазматических включений хламидий.

2) Высокой информативностью обладают молекулярно-биологические методы. В диагностике хламидиоза используют ПЦР, ЛЦР, транскрипционную амплификацию (основана на специфической нуклеиновой последовательности, присущей только ДНК или РНК хламидий) и метод амплификации со смещением нитей ДНК.

3) Выделение хламидий в культурах клеток (метод является одним из доказательных, но и трудоемким). После выделения культуры ее окрашивают по Романовскому-Гимза; оценивают в световом микроскопе при масляной иммерсии — на наличие цитоплазматических включений. Элементарные тельца хламидий красятся в красный цвет, а ретикулярные — в синий. При окрашивании препаратов флюоресцентными антителами и исследовании методом ПИФ, их смотрят под люминесцентным микроскопом. Как отмечено, преимущесвом метода является его специфичность (100%) и достаточно высокая чувствительность (75%). Однако, широкому применению метода препятствует его сложность, дороговизна, возможность получения результатов не ранее 72 ч, а также большой риск заражения персонала.

4) Выявление антигенов хламидий в исследуемом материале методом флюоресцирующих антител. Для диагностики хламидиоза используют МФА — в прямой и непрямой модификациях:

Прямой иммунофлюоресцентный метод (ПИФ заключается в соединении меченых флюорохромом антител со специфическим антигеном и наблюдении реакции при люминесцентной микроскопии); при этом хламидии могут оказаться в пораженных клетках в виде характерных цитоплазматических включений, окрашенных в ярко-зеленый цвет; или внеклеточно — в виде отдельных ярко-зеленых элементарных или ретикулярных телец. Результат считается позитивным, если в препарате внеклеточно определяется не менее 10 ярко-зеленых элементарных (в виде точки) или ретикулярных (в виде точки или овала) телец хламидий, которые четко выделяются на красном, желтом фоне контрастно окрашенных клеток. Выявление внутри клетки одного типичного цитоплазматического включения хламидий (изумрудного цвета) достаточно для положительного результата. Преимуществами метода является скорость при высокой чувствительности (85%), определение возбудителя в препарате;
Непрямой иммунофлюорерцентный метод (НИФ заключается в соединении меченых флюоресцином антител с комплексом специфического антигена с антихламидийными антителами). При этом антигены хламидий оказываются на оранжевом фоне цитоплазмы внутри эпителиальных клеток в виде цитоплазматических включений, флюоресцирующих ярко-зеленым или желтовато-зеленым цветом. Позитивным является результат при наличии 5 или больше цитоплаз-матических включений.

5) Выявление антигенов хламидий методом иммуноферментного анализа (метод основан на взаимодействии моноклональных хламидийных антител, адсорбированных на поверхности лунок полистироловых планшетов, с хламидийным антигеном, который находится в исследуемых образцах, и образовании иммунных комплексов). Позитивными считаются образцы с расцветкой субстратного раствора, идентичного позитивным контрольным образцам. Чувствительность ИФА для выявления хламидий колеблется в пределах 50-70% (при уретритах); при бессимптомном заболевании у мужчин — снижается до 44-50%. При обследовании женщин эти показатели составляют 88-100%; при бессимптомных заболеваниях — 40% (что ограничивает использование ИФА при данной форме хламидиоза).

6) Обнаружение хламидийных антител иммунологическими методами;

а) Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Материалом для исследования является сыворотка крови больного, секреты половых желез и т.п. Оценку результатов проводят по степени специфической флюоресценции комплекса антигена (элементарных и ретикулярных телец) с антителом. Интенсивность свечения оценивают:

(4+) — очень яркая зеленая флюоресценция ЭТ и РТ хламидий;
(3+) — четкая ярко-зеленая флюоресценция ЭТ и РТ хламидий;
(2+) — удовлетворительная флюоресценция ЭТ и РТ хламидий;
(+) — слабая зеленая флюоресценция ЭТ и РТ хламидий.

Титром хламидийных антител в исследуемых сыворотках считают то наибольшее разведение, при котором наблюдается четкая ярко-зеленая флюоресценция, связанная с хорошо различимыми ЭТ и РТ хламидий не менее, чем на 2+. При негативных результатах флюоресценция отсутствует. Результат анализа считают позитивным при высоком титре антител (1:64 и выше) или при нарастании титра антител в парных сыворотках (в 3-4 раза от начального уровня), т.к. однократное выявление хламидийных антител может быть связано не только с текущим заболеванием, но и с перенесенной хламидийной инфекцией. При лечении титры антител могут снижаться;

б) выявление хламидийных антител иммуноферментным методом (ИФА — основан на взаимодействии хламидийного антигена, адсорбированного на поверхности лунок полистироловых планшетов с иммуноглобулинами (IgM, IgG) в сыворотках крови человека. Материал для исследования — сыворотки крови как свежеполученные, так и сохраненные при t+2-10°C (на протяжении 48 ч) или при -20°С (на протяжении 2 нед). Оценку результатов ИФА осуществляют с помощью иммуноферментного анализатора по величине ОП растворов в лунках планшета при длине волны 492 нм. При этом сравнивают интенсивность цвета субстратного раствора в лунках с контролем.

Интенсивность цвета изменяется — от светло-желтого к бесцветному в лунках (с отрицательным контролем) и к оранжево-коричневому в лунках с политивными контрольными образцами. Позитивными считаются образцы с расцветкой субстратного раствора, идентичного позитивным контрольным образцам. Позитивными считаются образцы, которые обнаружили ОП, втрое выше ОП отрицательного контроля;

в) реакция связывания комплемента (РСК — выявляет антитела к родоспецифическому антигену хламидий). РСК мало подходит для диагностики заболеваний глаз и генитальной инфекции. Диагноз считают позитивным только при титрах антител 1:64 и выше (или при выраженной сероконверсии);

г) реакция непрямой гемаглютинации (РИГА — используется для диагностики зоонозных хла- мидиозов и первичного серологического скрининга антропонозных хламидиозов).

а) иммунофильтрация (специфическая иммунологическая реакция реализуется на фильтре сложной структуры, одновременно выполняющем функцию иммуносорбента).

б) иммунохроматография (реализуется в виде диагностических полосок, а также кассет, мембран; при положительном результате в определенном месте тестполоски появляется окрашенная зона: метод характеризуется простотой выполнения, однако обычно дает качественный, а не количественный ответ). Экспресс- методы предназначены для предварительного обследования; их можно использовать в небольших лабораториях; их отличает дешевизна, быстрота исследования; чувствительность их не превышает 65%, а специфичность близка к 100%.

PS: посмотрите как выглядят хламидии под микроскопом.

Статья диагностика хламидиоза.

med-brand.ru

Цитоплазматические включения

Нередко в цитоплазме бактерий обнаруживаются различные включения, которые образуются в процессе жизнедеятельности: капельки нейтральных липидов, воска, серы, гранулеза (сферическое запасное углеводное вещество, накапливающееся у бактерий рода Clostridium), гранулы гликогена, β-гидроксимасляной кислоты – ПОМ (особенно у рода Bacillus). Гранулеза, гликоген, ПОМ служат для бактерий запасным источником энергии. У некоторых бактерий в цитоплазме находятся кристаллы белковой природы, обладающие ядовитым действием на насекомых.

Некоторые бактерии способны накапливать фосфорную кислоту в виде гранул полифосфата (зерна волютина, метахроматические зерна, зерна Бабеша-Эрнста). Они играют роль фосфатных депо и регулярно выявляются у коринебактерий, микобактерий и спирилл в виде плотных, хорошо контурированных образований в форме шара или эллипса, располагающихся, в основном, у полюсов клетки. Обычно на полюсах бывает по одной грануле.

Наличие зерен волютина у бактерий определяют методом Нейссера.

Метод окраски по Нейссеру

Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синей 4 мин, затем сливают краску.
Промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30 сек.
Не промывая водой, окрашивают везувином 1-3 мин.
Промывают водой, высушивают.

Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина - в темно-синий, почти черный цвет.

Нуклеоид

Нуклеоид – ядерный аппарат бактерий. Представлен молекулой ДНК, соответствующей одной хромосоме. Она циркулярно замкнута, располагается в ядерной вакуоле, не имеет ограничивающей от цитоплазмы мембраны и митотического аппарата.

С ДНК связано небольшое количество РНК и РНК-полимеразы. ДНК свернуто вокруг центрального стержня, состоящего из РНК и представляет собой высокоупорядоченную компактную структуру. Хромосомы большинства прокариот имеют молекулярную массу в пределах 1-3х109, константу седиментации 1300-2000 S. Молекула ДНК включает 1,6х107нуклеотидных пар. Различия в генетическом аппарате прокариотных и эукариотных клеток обуславливает его название: у первых – нуклеоид (образование подобное ядру), в отличие от ядра у вторых.

В нуклеоиде бактерий содержится основная наследственная информация, которая реализуется в синтезе специфических белковых молекул. С ДНК бактериальной клетки связаны системы репликации, репарации, транскрипции и трансляции.

Нуклеоид в прокариотной клетке может быть выявлен в окрашенных препаратах с помощью светового или фазово-контрастного микроскопа. Для окрашивания ядерного вещества используется краситель Фельгена, который специфически окрашивает ДНК.

У многих бактерий в цитоплазме обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды. Они представляют собой замкнутые в кольца двухцепочечные ДНК, состоящие из 1500-40 000 пар нуклеотидов и содержащие до 100 генов.

Плазмиды могут существовать в клетке и в интегрированном состоянии с бактериальной хромосомой, сохраняя при этом способность переходить к автономии.

Капсула

Капсула – слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов (пневмококк) или полипептидов (бацилла сибирской язвы). Микрокапсулу (толщиной менее 0,2 мкм) способны формировать большинство бактерий, четко выраженную макрокапсулу (толщиной более 0,2 мкм) формируют пневмококк, клебсиеллы, возбудитель сибирской язвы и некоторые другие. У патогенных бактерий капсула образуется в макроорганизме, на искусственных питательных средах она обычно утрачивается (за исключением клебсиелл).

В организме человека и животных капсула защищает патогенные бактерии от бактериофага, фагоцитоза и гуморальных факторов иммунитета, определяет антигенную специфичность микроорганизмов.

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краситель, и для их выявления чаще всего применяют методы негативного контрастирования.

Метод выявления капсулы по Бурри-Гинсу

На середину предметного стекла наносят каплю черной туши и смешивают ее с помощью петли с каплей культуры капсульных бактерий.
Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени горелки.
Окрашивают 5 мин карболовым фуксином, разведенным водой 1:3.
Осторожно промывают водой, высушивают.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата.

studfiles.net

Ваше имя
Контактный телефон